Una tecnica fotoacustica per osservare la struttura delle cellule

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Cellule sanguigne osservate con la PAM convenzionale e, nella seconda immagine, con il fotodecadimento. (Crediti: J. Yao/Washington Univ.).

L’imaging fotoacustica è come un’ecografia, ma utilizza impulsi di luce per generare le onde sonore all’interno dei tessuti da osservare, siano essi vasi sanguigni o tumori. Una nuova tecnica fotoacustica descritta nella rivista Physical Review Letters, migliora la risoluzione ben oltre il limite di diffrazione consueto, consentendo ai ricercatori di distinguere singole cellule e le strutture al loro interno. Il metodo potrebbe consentire l’imaging subcellulare di tessuti biologici senza la necessità di aggiungere coloranti fluorescenti o altri mezzi di contrasto.

Vediamo di capire meglio di cosa si tratta. La microscopia fotoacustica (o PAM) si basa sull’effetto che le conferisce il nome: un breve impulso di luce colpisce, ad esempio, un tessuto provocando un riscaldamento e una conseguente espansione che, a sua volta, genera onde sonore che vengono rilevate da un trasduttore. Più forte è l’assorbimento della luce in una particolare regione più intenso è il suono emesso. Per costruire l’immagine di un tessuto biologico i ricercatori hanno concentrato il laser in molti punti sequenziali all’interno del campione e, successivamente, hanno registrano un singolo “pixel” di dati da ciascuno.

Determinate biomolecole – l’emoglobina nel sangue o la melanina nella pelle – forniscono segnali fotoacustici molto forti; di conseguenza, quando sono presenti, nessun colorante artificiale è richiesto per “illuminare” la struttura cellulare (altre tecniche, come la microscopia a fluorescenza, di solito richiedono coloranti o altri mezzi di contrasto). Ma PAM può sorprenderci fornendoci immagini della struttura di un esemplare vivente sfruttando la capacità delle onde sonore di percorrere lunghe distanze attraverso i tessuti – molto più lunghe di quanto non faccia il bagliore della fluorescenza. Ed è in questo modo che è stato possibile mappare per la prima volta i vasi sanguigni in una mano umana.

La risoluzione spaziale di PAM è determinata dalla larghezza della regione focale del laser che, ovviamente, non può essere spinto oltre circa 200 nanometri, il limite di diffrazione della luce laser. Ma niente paura: la microscopia a fluorescenza, come altre tecniche, hanno sapienti trucchi per battere il limite di diffrazione: ora, Junjie Yao ei suoi colleghi della Washington University di St. Louis hanno sviluppato il primo sistema di questo tipo per PAM. Come alcune tecniche di fluorescenza ad alta risoluzione, il nuovo sistema PAM sfrutta il fotodecadimento, un effetto per cui alcune molecole perdono la loro capacità di assorbire la luce di una particolare lunghezza d’onda dopo essere stato colpite con un impulso di quella stessa lunghezza.

Nel caso di PAM modificato, il “photobleaching è in realtà un sottoprodotto indesiderato della bioimaging ottica, ed è davvero difficile da evitare”, spiega Yao. “Il nostro metodo aggira questo inconveniente in un miglioramento utile nella risoluzione spaziale dell’immagine”. In questa tecnica, i ricercatori utilizzano due impulsi consecutivi focalizzati nello stesso punto. Il primo impulso fa “decadere” prevalentemente quelle molecole che si situano nel centro del punto focale, in cui l’intensità è massima, lasciando la maggior parte delle molecole periferiche ancora libere. Il secondo impulso, invece, è solo in grado di generare onde sonore nella regione periferica che circonda quella centrale. Quando i ricercatori hanno sottratto la banda del secondo segnale sonoro dal primo, si sono trovati di fronte alla seconda immagine riportata all’inizio della pagina: i bordi erano sfocati.

La risoluzione ne risultava migliorata di un fattore di 1,7 per i globuli rossi pieni di emoglobina e di un fattore di 2.0 per le cellule di melanina. E la tecnica funziona: lo conferma la ripresa di nanoparticelle d’oro che, pur non avendo una struttura interna sono abbastanza piccole (150 nanometri di diametro) per servire da test di risoluzione. L’esperimento è giunto ad una risoluzione di 80 nanometri, un fattore al di sotto del limite di diffrazione: sono fondate le speranze di aver trovato una tecnica molto utile nello studio della struttura cellulare e subcellulare, che mostri caratteristiche visibili con un raggio inferiore al limite di diffrazione (per la diagnosi del melanoma sarebbe un passo avanti).(Summary dell’articolo: http://physics.aps.org/articles/v7/3).

Papers di riferimento:

Junjie Yao, Lidai Wang, Chiye Li, Chi Zhang, and Lihong V. Wang, “Photoimprint Photoacoustic Microscopy for Three-Dimensional Label-Free Subdiffraction Imaging”, in Phys. Rev. Lett. 112, 014302 (2014).

L. Wang, J. Xia, J. Yao, K. I. Maslov, and L. V. Wang, “Ultrasonically Encoded Photoacoustic Flowgraphy in Biological Tissue,” Phys. Rev. Lett. 111, 204301 (2013).

Hao F Zhang, Konstantin Maslov, George Stoica, and Lihong V Wang, “Functional photoacoustic microscopy for high-resolution and noninvasive in vivo imaging,” Nature Biotech. 24, 848 (2006).

E. Betzig, G. H. Patterson, R. Sougrat, O. W. Lindwasser, S. Olenych, J. S. Bonifacino, M. W. Davidson, J. Lippincott-Schwartz, and H. F. Hess, “Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution,” Science 313, 1642 (2006).

Stefan W. Hell and Jan Wichmann, “Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy,” Optics Letters 19, 780 (1994).

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